Bernsteinsäure-Produktion

Hintergrund und Zielsetzung

Bernsteinsäure ist eine Dicarbonsäure und kommt als Stoffwechsel‑Zwischenprodukt im Citrat-Zyklus nahezu aller Lebewesen vor. Sie kann biotechnisch aus nachwachsenden Rohstoffen hergestellt werden. Neben einigen Pilzen und einer Handvoll Bakterienarten waren bisher allerdings keine natürlichen Organismen bekannt, die Bernsteinsäure in ausreichender Menge und unter solchen Bedingungen produzieren, dass ein entsprechendes industrielles Verfahren konkurrenzfähig zur chemischen Synthese durchgeführt werden könnte. Ziel dieses Projektes ist es, ein effizientes biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure aus nachwachsenden Rohstoffen zu etablieren.

Vorgehensweise

Um das oben genannte Ziel zur erreichen, wurde aus einer Bodenprobe ein viel versprechendes bisher unbekanntes Bakterium isoliert, das in der Lage ist, Bernsteinsäure aus nachwachsenden Rohstoffen herzustellen. Zurzeit steht die Identifizierung und Charakterisierung des Stammes an. Parallel werden Wachstums- und Produktionsbedingungen optimiert. Insbesondere physikalische Parameter, wie pH-Wert, Redox-Potenzial, Sauerstoffeintrag, Temperatur, aber auch die Medienzusammensetzung stehen auf dem Prüfstand. Dabei steht der Einsatz preiswerter Kohlenstoff- und Stickstoffquellen auf Basis landwirtschaftlicher Roh- und Reststoffe (Hemicellulose-Zucker, Pflanzenrückstände, diverse Presskuchen, Glycerin u. ä.) im Vordergrund. Abschließend könnte es sich als günstig erweisen, die hoch produktive Biomasse zu immobilisieren, d. h. in einer biokompatiblen makroskopischen Matrix einzuschließen, in der sie weiterlebt und produziert. So ist es möglich, die Biomasse über mehrere Zyklen zur Bernsteinsäureproduktion einzusetzen und leicht von der Produktbrühe abzutrennen. Ein zusätzlicher Vorteil wäre die erhöhte Produktivität, die sich durch die hohe Zellkonzentration im Bioreaktor ergibt.

Daten und Methoden

Um die zeitaufwendigen Stamm-Charakterisierungen und die anschließenden Optimierungsversuche unter verschiedensten Gesichtspunkten durchführen zu können, steht ein Laborroboter-System für ein Hochdurchsatz-Screening und zur Medienoptimierung zur Verfügung.
Für die Untersuchungen physikochemischer Parameter, dem Einsatz immobilisierter Biomasse sowie der Maßstabsvergrößerung stehen ein 4-fach-Parallelbioreaktor sowie mehrere Prozess-Bioreaktoren (5-15 L) zur Verfügung. Zur Analytik werden schnelle, halbquantitative Methoden genutzt, wie leistungsfähige und umfassende online-Sensorik, Kapillarelektrophorese (CE), Dünnschichtchromatographie (DC) und Spektroskopie. Die präzise Stoffanalytik für Bilanzierungen und Nebenprodukt-Bestimmung erfolgt mittels HPLC und GC.

Unsere Forschungsfragen

Im Rahmen des Projektes sollen bevorzugt solche Parameter bearbeitet werden, die es erlauben, die neuartigen Eigenschaften eines potenziellen Produktionsstammes optimal in einem technischen Prozess umzusetzen, wobei eine möglichst hohe Produktivität (P), Ausbeute (Y) und Produktkonzentration(C) erzielt werden sollen.

Ergebnisse

Ziel dieses Projektes ist es, ein effizientes biotechnisches Verfahren zur Herstellung von Bernsteinsäure aus nachwachsenden Rohstoffen zu etablieren. Erste Ergebnisse im Bereich der Umwandlung von Glycerin in Bernsteinsäure sind sehr vielversprechend. Hier wurden bereits über 100 g/L Bernsteinsäure mit einer massebezogenen Ausbeute von 100 % erzielt, was nur möglich ist, wenn im Stoffwechsel zumindest teilweise der rückläufige (reduktive) Citrat-Zyklus inklusive CO₂-Fixierung beschritten wird (anaerobe Atmung, Fumarat-Atmung).

In dem Projekt wurde ein bisher unbekannter Bodenorganismus für die biotechnologische Produktion von Bernsteinsäure unter Verwendung von Glycerin und einer Carbonatquelle (Magnesiumcarbonat und Natriumcarbonat) untersucht. Bei dem Bodenbakterium wurde herausgestellt, dass es sich um eine nicht trennbare Mischkultur handelt. Für die Bildung der Bernsteinsäure wurde in diesem symbiontischen Zellverband ein neuer Organismus, der zur Gruppe der Actinomyceten gezählt wird, ausgemacht. Unter mikroaerophilen Bedingungen bildet dieser im Satzbetrieb Bernsteinsäure mit 87 g/L als Hauptprodukt bei einem Yield von 0,9 g/g und einer maximalen Produktivät von 0,66 g/(L∙h). Ein mikroaerophiles Milieu wird durch die Kultivierung in Schottflaschen mit einer Kanüle und einem Septum im Deckel gewährleistet. Eine geringe tägliche Luftzufuhr wird zusätzlich durch einmalige Probenahme gewährleistet. Dabei sollte das Arbeitsvolumen in den Schottflaschen 50 % vom Gesamtvolumen der Flaschen entsprechen. Durch Supplementierung von Asparaginsäure, Glutaminsäure und Phenylalanin sowie des B-Vitamins Pantothensäure wird die Produktion begünstigt.
Im Bioreaktor wurde sowohl mit Magnesiumcarbonat, als auch mit Natriumcarbonat als Puffer gearbeitet. Es konnte eine geeignete Begasungsstrategie gefunden werden. Die Prozessparameter pH-Wert, Temperatur, Rührerdrehzahl, Redoxpotential, sowie der Einfluss der inititalen Glycerinkonzentration wurden überprüft.
Im Zulaufverfahren wurde eine Bernsteinsäureendkonzentration von 133 g/L erreicht. Bei wachstumsentkoppelter Produktion erreichen Yield und Produktivität 1,15 g/g bzw. 0,39 g/(L∙h).