DNA-freie Genom-Editierung in der Pappel

Hintergrund und Zielsetzung

- Die schnell wachsende Weltbevölkerung und der rasch voranschreitende Klimawandel sind bedeutende Herausforderungen für die Zukunft. Neben der Sicherstellung ausreichender Mengen an qualitativ hochwertigen Lebensmitteln müssen auch genügende Mengen an nachwachsenden Rohstoffressourcen erzeugt werden, z.B. Holz, das aus Bäumen gewonnen wird, die entweder in Wäldern oder in Kurzumtriebsplantagen kultiviert wurden. Der Satz an neuartigen Züchtungstechniken, insbesondere CRISPR/Cas9, bietet die Möglichkeit, die Züchtung von Bäumen signifikant zu beschleunigen. Dieses Projekt zielt in einem methodischen Ansatz darauf ab, zwei verschiedene CRISPR/Cas9-Systeme in Pappeln zu testen, die zu nicht-transgenen genom-editierten Pflanzen führen.

Vorgehensweise

Zwei verschiedene CRISPR/Cas9-Systeme werden in Pappeln getestet: (i) Plasmid, das Cas9-Gen und guideRNA (gRNA) enthält und (ii) DNA-freier Cas9/gRNA-Ribonuklein-Proteinkomplex. Das PDS-Gen ist nicht von kommerziellem Interesse, jedoch dient es in diesem zwei Jahre laufenden „Proof-of-Concept“-Projekt als leicht nachweisbares Markergen für eine erfolgreiche PDS-Gen-Editierung. Im Erfolgsfall kann das PDS-Gen gegen ein beliebiges kommerziell interessantes Gen ausgetauscht werden.

Beide Systeme, die gRNA für das PHYTOENE DESATURASE (PDS)-Gen enthalten, werden transient sowohl auf Pappelprotoplasten als auch auf keimenden Pollen übertragen. CRISPR/Cas9-behandelte Protoplasten werden bis zum Kallusstadium kultiviert. Erhaltene Kalli werden auf editierte Bereiche im PDS-Kandidatengen hin untersucht und Pflanzen werden regeneriert.

Keimender Pollen, der mit beiden Komplexen (CRISPR/Cas9-Plasmid-DNA und Ribonukleinprotein) behandelt wurde, wird verwendet, um weibliche Pappel zu bestäuben. Wir können Kreuzungen an 6-8 Monate alten Pappel durchführen. F1-Keimlinge werden auf editierte Bereiche im PDS-Gen hin untersucht, und nach 6-8 Monaten werden erneut eine Blüte induziert und Kreuzungen durchgeführt. F2-Keimlinge werden auf homozygot editierte Bereiche im PDS-Gen hin untersucht. Pflanzen, die mit dieser Technologie hergestellt werden, gelten in Bezug auf die europäische Gesetzgebung immer noch als transgen. In diesem Projektvorschlag wird die Technologie der frühen Blüte nur zur Prüfung des „Proof-of-Concept“-Ansatzes verwendet und in einer möglichen praktischen Anwendung nicht berücksichtigt.